DNA

Replicación del ácido desoxirribonucleico (DNA)

La preservación de las especies sobre el planeta implica la necesidad de la reproducción de las diferentes formas de vida. Cada especie tiene características únicas, que en su mayoría son el resultado de la expresión de su carga genética. Desde este punto de vista, uno de los procesos biológicos celulares más relevante es la replicación del

DNA, molécula que guarda en su secuencia de bases la información genética que distingue a los individuos como integrantes de una especie en particular. El DNA está formado por dos hilos de nucleótidos enrollados uno sobre el otro, formando una hélice doble guardada en la profundidad de las células. En cada ciclo celular, las hebras de la molécula de DNA se separan y se copian con la más alta fidelidad, para luego volver a reformar la doble hélice,

en una danza eterna que mantiene vigente la vida hasta nuestros días.

CICLO CELULAR EN ASOCIACIÓN CON LA REPLICACIÓN

Todos los organismos vivos tienen un ciclo de vida, compuesto de etapas que se van alcanzando de manera consecutiva en el tiempo. Las células, como componentes

básicos de todos los organismos, también atraviesan fases temporales que conforman su ciclo denominado ciclo celular.

En la fase G1, la célula inicia su ciclo de vida con un tamaño reducido. Durante esta etapa, se dedicará a aumentar su tamaño y a llevar a cabo las funciones celulares típicas de la interfase. En algún momento de G1, las células pueden entrar en una etapa de especialización denominada G0, donde realizarán funciones específicas y no se dividirán por un tiempo indeterminado. En este caso están las neuronas y las células hepáticas maduras.

Las células que no entran en G0 continúan a la fase S,

que es la etapa en la cual se replica el material genético.Durante este periodo, la célula debe asegurar que todo el DNA que conforma su genoma se copie, generando dos

moléculas idénticas. En la siguiente fase, denominada G2, se activan los

mecanismos de revisión y reparación del genoma, para asegurar en la medida de lo posible que las moléculas de DNA generadas en la fase S no contengan errores de copia que sean incompatibles con la supervivencia de la descendencia. En esta fase es cuando se activan también los mecanismos de división celular que darán origen a las

células hijas.

Finalmente, en la fase M se lleva a cabo la división física de la célula original, que ahora da lugar a dos células hijas, cada una de las cuales contiene una de las copias de DNA que se generaron durante la fase S.

ORIGEN DE LA REPLICACIÓN

El DNA es una hebra doble de nucleótidos con una secuencia determinada, que no tiene señales adicionales que diferencien las funciones de una secuencia en particular.

Se sabe que en esas hileras de nucleótidos están ubicados los genes, y que cada uno de ellos proporciona información para construir organismos, pero no hay señales que muestren dónde inicia y dónde termina determinado gen; del mismo modo, sabemos que, además de genes, el DNA también contiene secuencias específi cas que no generan productos génicos, pero que son primordiales para que los genes puedan regularse de manera adecuada. Entre otras secuencias de esta naturaleza, está el llamado origen de replicación, que es el sitio donde debe iniciar la copia del material genético, en cada ciclo celular.

ENZIMAS PARTICIPANTES EN LA REPLICACIÓN

La replicación del DNA es un proceso dinámico, que

comprende la participación de varias enzimas que se

coordinan para generar una copia casi siempre 100%

idéntica a la molécula original. Al fi nal del proceso, cada

una de las copias nuevas forma una doble hélice con la hebra original que le sirvió de molde. El conjunto básico de las enzimas que participan en el proceso se conoce como maquinaria de replicación, y está formada por las

siguientes proteínas

Polimerasa de DNA

se conocen tres tipos de polimerasas de DNA, caracterizadas en E. coli , denominadas I, II y III, según el orden en que fueron descubiertas. Las de tipo I y II funcionan sobre todo en los procesos de reparación del DNA, en tanto que la de tipo III es la encargada de catalizar la elongación de la cadena del DNA durante el proceso de replicación. Esta proteína es de estructura compleja; está formada de varias subunidades, que juntas constituyen una molécula de 600 kDa aproximadamente. Las subunidadesα,εyθforman el núcleo de la enzima, que contiene las actividades de polimerización 5′→3′yde exonucleasa 3′→5′, que le permiten agregar nucleó-tidos trifosfatados a la cadena en crecimiento, y retirar en el momento cualquier nucleótido que se haya inser- tado de manera equivocada (corrección de lectura). La subunidad β es un homodímero con estructura en forma de aro, que tiene la capacidad de abrirse y cerrarse alrededor del DNA, y luego deslizarse por toda la longitud de la molécula, con el centro enzimático de la enzima unido a ella (fi g. 3-4). A esta capacidad de mantenerse sobre la cadena molde se le llama procesividad. Las
γ , δ ,δ′ , χ y ψ forman en conjunto el complejo γ , cuya función es abrir y ubicar a la subunidad β sobre el dúplex de DNA, en una reacción que requiere ATP, y descargarla cuando se ha completado el proceso de replicación.

Helicasas

Son proteínas que utilizan la energía de los enlaces del ATP para catalizar el desenrollamiento parcial y transi torio de moléculas de ácidos nucleicos de doble hebra.

Para realizar su función, las helicasas por lo general se reúnen en estructuras hexaméricas que adquieren una forma tridimensional de anillo. El hexámero contiene un dominio de unión al origen, que reconoce el sitio de origen de replicación y le permite ensamblarse a él. Este ensamble produce la distorsión y separación de la doble hebra de DNA, en presencia de ATP y iones Mg ++ Una vez sobre el DNA, las helicasas pueden desplazarse a lo largo de cada una de las hebras en dirección 5′→3′. A medida que se desplazan, utilizan energía química que proviene de la hidrólisis del ATP para romper los puentes de hidró-

geno entre las bases, produciendo así la abertura de la molécula.

Primasas

Las primasas son enzimas que catalizan la formación de pequeños segmentos de RNA, de unos 11 nucleótidos de longitud, llamados cebadores o primers, y que son absolutamente indispensables para que la polimerasa de DNA funcione, ya que ésta, como se mencionó, requiere la presencia de un extremo 3′ libre preexistente para iniciar la síntesis de DNA.

Proteínas ssb

Llamadas de este modo por las siglas en inglés de “proteína estabilizadora de la hebra simple” (single strain binding protein), son moléculas que se unen cooperativamente a la hebra abierta del DNA, impidiendo que tome su confi guración de hebra doble. Se presentan en forma de homotetrámeros, cada uno de los cuales abarca alrededor de 35 nucleótidos, a los que se unen sin ningún tipo de especifi cidad.

Ligasas

Son enzimas que catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos de dos hebras de ácidos nucleicos. Hay dos clases, según la fuente de energía que prefi eren: las que utilizan NAD+ como cofactor y que existen en las bacterias, y las que usan ATP como cofactor, específi cas de los eucariontes. Su mecanismo de acción requiere tres pasos:

a) Formación de un enlace covalente entre la enzima y su cofactor. Esto produce la liberación de una molécula de PPi.

b) Transferencia del nucleótido del AMP al fosfato del extremo 5′ del DNA que se va a sellar.

c) Formación de un enlace fosfodiéster con la liberación de AMP

Topoisomerasas

Son enzimas que cortan y ligan el DNA cambiando su topología, sea induciendo la formación de giros o relajando superenrollamientos. El corte se hace a nivel del enlace fosfodiéster, transfi riéndolo a un residuo de tirosina de la enzima, en un proceso que requiere la presencia de iones magnesio. Según el efecto que tienen las topoisomerasas sobre la molécula de DNA, se han clasifi cado como sigue: • Tipo I: interaccionan de preferencia con DNA superenrollado, induciendo un corte en una de las hebras, pasando la otra hebra por el corte, y volviendo a sellar, relajando de este modo la molécula. No requieren ATP para funcionar. • Tipo II: al contrario del tipo I, éstas se unen a DNA relajado, induciendo superenrollamientos. Sin embargo, en presencia de DNA superenrollado negativamente, inducen corte y ligamiento de la doble hebra, produciendo su relajación, en un proceso que requiere la presencia de ATP. En las bacterias, las enzimas girasas son topoisomerasas de este tipo.

Estructura molecular, función y métodos de estudio de las proteínas

PROTEÍNAS

Las proteínas son macromoléculas, polipéptidos naturales y uno de los componentes fundamentales y más abundantes de las células; participan y se encuentran en los procesos y estructuras más importantes de los organismos y muestran una gran diversidad en sus propiedades físicas, desde las enzimas solubles en agua, hasta la queratina insoluble del pelo. Los componentes básicos de las proteínas son los aminoácidos; las cadenas grandes de estos aminoácidos son las proteínas. La información para la síntesis de una proteína está codifi cada en el DNA, pero realmente son las proteínas y no el DNA las que determinan la forma de las células así como las funciones de reconocimiento, regulación y catálisis; en otras palabras, las proteínas son las moléculas a través de las cuales se expresa la información genética.

AMINOACIDOS

Todas las proteínas están constituidas por aminoácidos unidos en una secuencia lineal mediante un tipo especíco de enlace covalente (enlace peptídico) formado entre
el grupo amino de un aminoácido (—NH2) y el grupo carboxilo (—COOH) del aminoácido precedente. Cabe señalar que las células tienen la capacidad de sintetizar
proteínas muy diversas, en cuanto a su tamaño, actividad o función biológica mediante el uso combinado de los 20 aminoácidos. A partir de estas combinaciones, las células tienen la capacidad de sintetizar proteínas, como anticuerpos, enzimas, hormonas, proteínas estructurales y más. Todos los aminoácidos que se hallan en las proteínas son alfa aminoácidos; es decir, en todos ellos el carbono α (alfa) es asimétrico y está unido a cuatro grupos diferentes: el grupo carboxilo, el grupo amino, un grupo R y un átomo de hidrógeno. Debido a la disposición tetraédrica de los orbitales de enlace alrededor del carbono α, los cuatro grupos pueden ocupar dos disposiciones diferentes en el espacio; a estas dos formas se les denomina enantiómeros o estereoisómeros.

ENLACE PEPTIDICO

En las proteínas, el enlace peptídico es un enlace covalente
que se establece entre el grupo carboxilo de un aminoácido
y el grupo amino de otro. La formación de un
dipéptido a partir de dos aminoácidos conlleva la pérdida
de una molécula de agua (fi g. 1-13). La unión de varios
aminoácidos mediante enlaces peptídicos forma una cadena polipeptídica, la cual no es ramificada .
En una cadena polipeptídica o proteína, a un aminoácido
se le denomina residuo; esta cadena consiste en una parte
repetida regularmente llamada cadena principal y de una
parte variable que corresponde a las cadenas laterales de
los aminoácidos. El peso promedio de un residuo de aminoácido
es de alrededor de 110 daltones (un daltón es igual a una unidad de masa atómica). Por ejemplo, una proteína con peso molecular de 30 000 tiene una masa de 30 000 daltones o 30 kDa.

 

ESTRUCTURA DE LAS PROTEINAS

La conformación de una proteína se defi ne por cuatro niveles estructurales:

•  Estructura primaria
•  Estructura secundaria
•  Estructura terciaria
•  Estructura cuaternaria.

Funciones de  las proteicaS

El papel medular de las proteínas en las células queda plasmado en el hecho de que la información genética se expresa finalmente en forma de proteína. Para cada proteína expresada en algún momento biológico existe un segmento de DNA (gen) que codifica la información de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Una célula es capaz de sintetizar miles de proteínas diferentes a la vez, cada una de ellas codifi cada por un gen y encargada de una función específi ca dentro de la biología de la célula o del organismo del cual ésta forma parte. Todas las funciones biológicas de los organismos, sean éstos unicelulares o pluricelulares, incluyen la participación de una o hasta varias proteínas. Las proteínas actúan como estructuras con funciones mecánicas o de soporte, como catalizadores de reacciones enzimáticas y realizando un gran número de funciones. Se conocen numerosas funciones de una gran cantidad de proteínas (y seguramente es mucho más lo que se desconoce).

Métodos de estudio de las proteínas

Una de las principales metas de la bioquímica es investigar cómo las secuencias de aminoácidos determinan las conformaciones de las proteínas. Es importante saber cómo las proteínas se unen a sustratos específi cos y otras moléculas y cómo intervienen en la catálisis y transfi eren energía e información. Un paso indispensable en esos
estudios es la purifi cación de las proteínas de interés.Algunas de las metodologías para estudiar, purifi car y analizar proteínas son la electroforesis, la cromatografía y la secuenciación.

 

Composición y estructura de los ácidos nucleicos

COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Todos los seres vivos (procariontes y eucariontes) cuentan con dos tipos de ácidos nucleicos, el ácido desoxirribonucleico (DNA) y el ácido ribonucleico (RNA),
cada uno de ellos constituido por nucleótidos específicos. Cada nucleótido tiene tres componentes característicos: una base nitrogenada, un azúcar de 5 carbonos (pentosa)
y al menos un fosfato. Las bases nitrogenadas son moléculas heterocíclicas,
cuyos anillos moleculares están estructurados tanto por carbono como por nitrógeno. Derivan de dos tipos de compuestos conocidos como purina (estructura cíclica de nueve puntas, hexágono-pentágono fusionados) y pirimidina (estructura cíclica de seis puntas, hexagonal). La adenina (A) y la guanina (G) son bases púricas comunes a ambos tipos de ácidos nucleicos, en tanto que la citosina (C) también está presente en ambos tipos de ácidos nucleicos; la timina (T) exclusiva del DNA y el uracilo (U) exclusivo del RNA son bases pirimídicas. Las pentosas son monosacáridos de cinco carbonos que adquieren estructuras heterocíclicas tipo furano (β-furanosas), a través de la esterifi cación del oxígeno del grupo carbonilo aldehídico con el hidroxilo del último carbón asimétrico de la molécula. Los desoxiribonucleótidos del DNA contienen 2-desoxi-D-ribosa, en tanto que los ribonucleótidos del RNA contienen D-ribosa. Tanto los anillos heterocíclicos de las bases nitrogenadas como los de las pentosas se enumeran según la convención internacional para purina, pirimidina y furano; sin embargo, para hacer la distinción, los
números de la pentosa se designan como primos (1′-5′).
Cada base nitrogenada se une covalentemente a la pentosa para formar un nucleósido (denominados adenosina, guanosina, timidina, citidina y uridina, respectivamente), a través de una unión N-β-glucosil (N-9 de las purinas y N-1 de las pirimidinas) al carbono 1′ de la pentosa. Este tipo de unión se forma al quitar un grupo hidroxilo de la pentosa y un hidrógeno de la base, con la consecuente formación de una molécula de agua y un
enlace O-glucosídico.

DESCUBRIMIENTO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

El estudio de los ácidos nucleicos se inició con los trabajos iniciales de Johan Friedrich Miescher, quien en 1869 logró aislar el contenido nuclear. Miescher observó que
se trataba de una sustancia ácida, rica en fósforo, compuesta por moléculas grandes, a la que llamó “nucleína”. Propuso que la nucleína podría ser “una forma de almacenar fósforo dentro de la célula o que tal vez pudiera estar implicada en la herencia”. En 1885, Oscar Harting propuso que la nucleína era la sustancia encargada no sólo de la fecundación, sino también de la transmisión de las características hereditarias; sin embargo, esta idea no  sería comprobada experimentalmente, sino hasta 1944 por el grupo de Oswald Avery.
La nucleína de Meischer era en realidad una mezcla de ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA) y proteínas coexistentes de manera estrecha a ambos ácidos. Sin embargo, hacia 1889, el grupo de Meischer logró purifi car por completo la nucleína, eliminando totalmente a las proteínas; fue entonces cuando Richard Altmann introdujo el término “ácido nucleico” para referirse a ese extracto purifi cado libre de proteínas.
Así, durante los últimos años del siglo XIX, los estudios sobre el contenido nuclear se enfocaron en el análisis e identifi cación de cada uno de los componentes de los ácidos
nucleicos, hechos históricos que se resumen en el cuadro 2-1.

ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

Estructura secundaria del DNA La doble hélice

Después de conocer el trabajo de Avery, publicado en
1944, Erwin Chargaff se interesó en el estudio de los ácidos nucleicos, y mediante técnicas cromatográfi cas analiz el DNA de varios tipos celulares, logrando establecer que la cantidad de adeninas era similar a la de timinas
([A] = [T]), y la de guaninas a la de citosinas ([G] = [C]), proponiendo que en el DNA existe la misma cantidad de bases púricas y pirimídicas ([purinas] = [pirimidinas]). Estas observaciones se dieron a conocer en 1951
y originaron lo que algunos autores refi eren como “leyes de equivalencia de las bases nitrogenadas”. Chargaff también observó que la composición de bases nitrogenadas
en el DNA variaba entre especies, pero se mantenía constante
en una misma especie, independientemente de la
edad o del estado nutricional. Las observaciones de Chargaff
pusieron de manifi esto, además de la complementariedad
entre bases púricas y pirimídicas, la posibilidad de
una estructura de doble hélice para el DNA.

Rosalind Franklin y Maurice Wilkins, a través de la cristalografía de rayos X, describieron a principios del decenio de 1950 que el DNA generaba una imagen helicoidal de doble hélice, con una estructura extendida, ordenada y constante, que poseía un diámetro de 20 Å (2 nm) y donde las bases nitrogenadas se encontraban apiladas
en planos cuya separación era de 3.4 Å (0.34 nm). Así, al analizar las evidencias químicas y físicas sobre la composición y estructura del DNA, James Watson y Francis Crick propusieron, en 1953, el modelo de la “doble hélice”  según el cual el DNA está formado por dos cadenas helicoidales, que giran alrededor del mismo eje en sentido dextrógiro, y con sus átomos orientados en sentido inverso, es decir, las cadenas son antiparalelas. En este modelo,
la β-D-desoxirribosa de un nucleótido se une a la del contiguo, a través de un enlace 3′-5′-fosfodiéster. En la parte externa de la hélice, se alternan fosfatos y desoxirribosas, en tanto que las bases se proyectan perpendicularmente hacia el interior de la doble hélice. Cada 3.4 Å (0.34 nm) se presenta un residuo nucleotídico, el cual se desplaza cerca de 36° en relación con el anterior, lo que hace posible que cada 10 pares de bases (pb) generen una vuelta (360°) (fi g. 2-10), en tanto que la distancia del fosfato al eje longitudinal de la fi bra de DNA es de 10 Å (1 nm). Los giros de las hebras del DNA no son simétricos a un solo eje; existe una proyección de los giros, que da origen a huecos asimétricos entre cada vuelta y que, por sus dimensiones, se denominaron hueco mayor y hueco
menor (22 y 12 Å de ancho, respectivamente) (fi g. 2-10). Dado que en este modelo los fosfatos se encuentran por fuera de la doble hélice, los cationes y las moléculas polares, como el agua, pueden acceder con facilidad a ella, por lo que Watson y Crick propusieron que un menor contenido de agua podría ocasionar que la estructura se
compactara. Para 1953, Freiser y Furberg ya habían propuesto que los fosfatos se hallaban en la parte externa de la molécula. No obstante, Freiser proponía un modelo de triple hélice, tal y como lo hicieron en su momento Pauling y Corey, ambos erróneos. Además de que el modelo de Watson y Crick era diferente a los propuestos con anterioridad incluía la propuesta novedosa de que las cadenas de la doble hélice se mantienen unidas a través de puentes de hidrógeno que se establecen entre la purina de una hebra y la pirimidina de la otra. El modelo supone que las bases nitrogenadas dentro del DNA se encuentran en su confi guración tautomérica más estable (grupo ceto) y propone apareamientos específi cos adenina-timina (A-T) y guanina-citosina (G-C), tal y como sugirió Chargaff en sus estudios. Dentro de las restricciones estructurales, Watson y Crick indican en su descripción que la pentosa debe posicionarse de modo perpendicular a las bases nitrogenadas y que los puentes de hidrógeno que se forman entre las bases nitrogenadas de las dos hebras deben ser también rigurosamente perpendiculares al eje longituddinal de la doble hélice. Además, la estructura que ellos describen sólo puede formarse si la pentosa es una 2-desoxirribosa, ya que el oxígeno de la posición 2 del azúcar generaría fuerzas de van der Waals más estrechas. En el modelo de doble hélice, se propuso de manera errónea que el apareamiento de bases era a través de dos puentes de hidrógeno tanto para A-T como para G-C. Hoy en día se conoce que la A interactúa con la T precisamente a través de dos puentes de hidrógeno, pero la interacción G-C es más fuerte, ya que puede establecer hasta tres puentes de hidrógeno  . Visionariamente, Watson y Crick propusieron que la complementariedad entre bases podría ser el mecanismo de copiado y duplicación del material genético, hecho que se revisa
con detalle en el capítulo de replicación del DNA.

Conformaciones de hebra sencilla, de triple y cuádruple hebra para el DNA